mRNA Cap2'-O-Methyltransferase |

mRNA Cap 2´ -O-methyltransferase ଏକ ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ ଇ କୋଲି ଷ୍ଟ୍ରେନରୁ ଉତ୍ପନ୍ନ ହୋଇଥିଲା ଯାହା ଟିକା ପାଇଁ mRNA କ୍ୟାପ 2 ´-O-Methyltransferase ପାଇଁ ଜିନ୍ ବହନ କରିଥାଏ |ଏହି ଏନଜାଇମ୍ RNA ର 5´end ରେ କ୍ୟାପ୍ ସଂରଚନା ସହିତ ଲାଗିଥିବା ପ୍ରଥମ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ ର 2´-O ସ୍ଥିତିରେ ଏକ ମିଥାଇଲ୍ ଗ୍ରୁପ୍ ଯୋଡିଥାଏ | -0) ଫଳସ୍ୱରୂପ ଏକ କ୍ୟାପ୍- structure ଗଠନ |

Cap1 ସଂରଚନା ଅନୁବାଦ ଦକ୍ଷତା ବୃଦ୍ଧି କରିପାରିବ, ଟ୍ରାନ୍ସଫେକ୍ସନ୍ ଏବଂ ମାଇକ୍ରୋ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ୍ ପରୀକ୍ଷଣରେ mRNA ର ଅଭିବ୍ୟକ୍ତିକୁ ଉନ୍ନତ କରିପାରିବ | ଏହି ଏନଜାଇମ୍ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଭାବରେ ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ଭାବରେ m7GpppN କ୍ୟାପ୍ ସହିତ RNA ଆବଶ୍ୟକ କରେ |ଏହା 5´ ଶେଷରେ pN, ppN, pppN କିମ୍ବା GpppN ସହିତ RNA ବ୍ୟବହାର କରିପାରିବ ନାହିଁ |କ୍ୟାପ୍ ଆନାଗଲ୍ ବ୍ୟବହାର କରି କିମ୍ବା ଭ୍ୟାକ୍ସିନିଆ କ୍ୟାପିଂ ଏନଜାଇମ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ଏନଜାଇମାଟିକ୍ କ୍ୟାପିଂ ମାଧ୍ୟମରେ ଭିଟ୍ରୋ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ମାଧ୍ୟମରେ କ୍ୟାପ୍ ହୋଇଥିବା RNA ପ୍ରସ୍ତୁତ ହୋଇପାରେ |

ଉପାଦାନଗୁଡ଼ିକ |

mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase (50U / μL)

10 × କ୍ୟାପିଂ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ବଫର୍ |

ଭଣ୍ଡାର

ଷ୍ଟୋରେଜ୍ ପାଇଁ -25 ～ - 15 repeated ବାରମ୍ବାର ଫ୍ରିଜ୍-ଥ୍ ଚକ୍ରରୁ ଦୂରେଇ ରୁହନ୍ତୁ）

ଷ୍ଟୋରେଜ୍ ବଫର୍ |

20 mM Tris-HCl （pH 8.0，25 ℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100 ， 50% glycerol |

ୟୁନିଟ୍ ସଂଜ୍ଞା

ଗୋଟିଏ ୟୁନିଟ୍ 37 ° C ରେ 1 ଘଣ୍ଟା ମଧ୍ୟରେ 80 nt କ୍ୟାପ୍ ହୋଇଥିବା RNA ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପ୍ଟର 10 ପମୋଲ୍ ମିଥାଇଲେଟ ପାଇଁ ଆବଶ୍ୟକ ଏନଜାଇମର ପରିମାଣ ଭାବରେ ବ୍ୟାଖ୍ୟା କରାଯାଇଛି |

ଗୁଣବତ୍ତା ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଅନୁଧ୍ୟାନ |

Exonuclease: 50U mRNA କ୍ୟାପ୍ 2 ´ -O- ମିଥାଇଲ୍ଟ୍ରାନ୍ସଫ୍ରେଜ୍ ସହିତ 1μg λ- ହିନ୍ଦ III ହଜମ DNA 37 37 ରେ 16 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ କ ag ଣସି ଅବକ୍ଷୟ ହୁଏ ନାହିଁ ଯାହା ଆଗରୋଜ୍ ଜେଲ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ ଦ୍ determined ାରା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା |

ଏଣ୍ଡୋନ୍ୟୁକ୍ଲିଜ୍ |: 50 U mRNA କ୍ୟାପ୍ 2 O -O- ମିଥାଇଲଟ୍ରାନ୍ସଫ୍ରେଜ୍ ସହିତ 1 μg λDNA ସହିତ 37 at 16 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ 16 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ କ ag ଣସି ଅବକ୍ଷୟ ହୁଏ ନାହିଁ ଯାହା ଆଗରୋଜ୍ ଜେଲ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ ଦ୍ determined ାରା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା |

ନିକେଜ୍ |: 50U ର mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase ସହିତ 1μg pBR322 ସହିତ 37 at 16 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ 16 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ କ ag ଣସି ଅବକ୍ଷୟ ହୁଏ ନାହିଁ ଯାହା ଆଗରୋଜ୍ ଜେଲ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ ଦ୍ determined ାରା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଏ |

RNase: 50U ର mRNA Cap 2 O -O-Methyltransferase ସହିତ 1.6μg MS2 RNA ସହିତ 4 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ 37 at ରେ କ ag ଣସି ଅବକ୍ଷୟ ହୁଏ ନାହିଁ ଯାହା ଆଗରୋଜ୍ ଜେଲ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ ଦ୍ determined ାରା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଏ |

E. କୋଲି DNA |: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase ର ଉପସ୍ଥିତି ପାଇଁ ସ୍କ୍ରିନ କରାଯାଏ |E. କୋଲି ପାଇଁ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପ୍ରାଇମର୍ ସହିତ TaqMan qPCR ବ୍ୟବହାର କରି ଜେନୋମିକ୍ DNA |E. କୋଲି 16S rRNA ଲୋକସ୍ |TheE. କୋଲି ଜେନୋମିକ୍ DNA ପ୍ରଦୂଷଣ ହେଉଛି = 1 |E. କୋଲି ଜିନୋମ |

ଜୀବାଣୁ ଏଣ୍ଡୋଟୋକ୍ସିନ୍ |: ଚାଇନିଜ୍ ଫାର୍ମାକୋପିୟା IV 2020 ସଂସ୍କରଣ ଅନୁଯାୟୀ LAL- ପରୀକ୍ଷା, ଜେଲ୍ ସୀମା ପରୀକ୍ଷା ପଦ୍ଧତି, ସାଧାରଣ ନିୟମ (1143) |ଜୀବାଣୁ ଏଣ୍ଡୋଟୋକ୍ସିନ ବିଷୟବସ୍ତୁ = 10 EU / mg ହେବା ଉଚିତ |

ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପ୍ରଣାଳୀ ଏବଂ ସର୍ତ୍ତ |

1. 1.5 ମିଲି ମାଇକ୍ରୋଫ୍ୟୁଜ୍ ଟ୍ୟୁବରେ ଉପଯୁକ୍ତ ପରିମାଣର କ୍ୟାପଡ୍ RNA ଏବଂ RNase ମୁକ୍ତ H2O କୁ 16.0 µL ର ଅନ୍ତିମ ପରିମାଣରେ ମିଶ୍ରଣ କରନ୍ତୁ |

2. minutes ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 65 at ରେ ଗରମ କରନ୍ତୁ ଏବଂ ପରେ 5 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ବରଫ ସ୍ନାନ କରନ୍ତୁ |

3. ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ କ୍ରମରେ ନିମ୍ନଲିଖିତ ଉପାଦାନଗୁଡ଼ିକୁ ଯୋଡନ୍ତୁ (କ୍ୟାପଡ୍ RNA ର ମିଥାଇଲେସନ୍ ପାଇଁ) |

୧୦ରୁ କମ୍

* 10 × କ୍ୟାପିଂ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ବଫର୍: 500 ମିମି ଟ୍ରାଇସ୍- HCl (pH 8.0, 25 ℃), 50 ମିମି KCl, 10 ମିମି MgCl2 、 10 ମିମି DTT |

4. 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ 37 at ରେ ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ କରନ୍ତୁ (200 nt ରୁ କମ୍ ଟାର୍ଗେଟ୍ ଖଣ୍ଡ ପାଇଁ 2 ଘଣ୍ଟା ଇନକ୍ୟୁବେସନ ସୁପାରିଶ କରାଯାଏ) |

ପ୍ରୟୋଗଗୁଡ଼ିକ

ମାଇକ୍ରୋ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ୍ ଏବଂ ଟ୍ରାନ୍ସଫେକ୍ସନ୍ ପରୀକ୍ଷଣ ସମୟରେ mRNA ଅଭିବ୍ୟକ୍ତିରେ ଉନ୍ନତି ଆଣିବା |

ବ୍ୟବହାର ଉପରେ ଟିପ୍ପଣୀ |

1. ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପୂର୍ବରୁ, RNA କୁ ଶୁଦ୍ଧ ଏବଂ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଜ୍ ମୁକ୍ତ ଜଳରେ ଦ୍ରବଣ କରାଯିବା ଉଚିତ୍, ସମସ୍ତ ସମାଧାନରେ କ ED ଣସି EDTA ଏବଂ ଆୟନ ରହିବା ଉଚିତ୍ ନୁହେଁ |

2. ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପ୍ଟର 5´end ରେ ଦ୍ secondary ିତୀୟ ସଂରଚନାକୁ ହଟାଇବା ପାଇଁ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପୂର୍ବରୁ 5 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ନମୁନା RNA କୁ 65 ମିନିଟରେ ଗରମ କରିବାକୁ ପରାମର୍ଶ ଦିଆଯାଇଛି |ଜଟିଳ 5 ter- ଟର୍ମିନାଲ୍ ଗଠନ ପାଇଁ ଏହା 10 ମିନିଟ୍ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇପାରେ |