PNGase F।
ଗ୍ଲାଇକୋପ୍ରୋଟିନରୁ ପ୍ରାୟ ସମସ୍ତ ଏନ-ଲିଙ୍କ୍ ହୋଇଥିବା ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ଅପସାରଣ ପାଇଁ ପେପ୍ଟାଇଡ୍-ଏନ-ଗ୍ଲାଇକୋସିଡେଜ୍ ଏଫ୍ (PNGase F) ହେଉଛି ସବୁଠାରୁ ପ୍ରଭାବଶାଳୀ ଏନଜାଇମାଟିକ୍ ପଦ୍ଧତି |PNGase F ହେଉଛି ଏକ ଆମିଡେଜ୍, ଯାହା N- ଲିଙ୍କ୍ ହୋଇଥିବା ଗ୍ଲାଇକୋପ୍ରୋଟେନ୍ ରୁ ଉଚ୍ଚ ମାନୋଜ୍, ହାଇବ୍ରିଡ୍ ଏବଂ ଜଟିଳ ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ ର ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ଅଧିକାଂଶ GlcNAc ଏବଂ ଅସରପା ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ମଧ୍ୟରେ ରହିଥାଏ |
ଆବେଦନ
ପ୍ରୋଟିନରୁ କାର୍ବୋହାଇଡ୍ରେଟ୍ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ଅପସାରଣ ପାଇଁ ଏହି ଏନଜାଇମ୍ ଉପଯୋଗୀ |
ପ୍ରସ୍ତୁତି ଏବଂ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟକରଣ |
| ଦୃଶ୍ୟ | ରଙ୍ଗହୀନ ତରଳ | |
| ପ୍ରୋଟିନ୍ ଶୁଦ୍ଧତା | | ≥95% (SDS-PAGE ରୁ) |
| କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ | ≥500,000 U / mL | |
| Exoglycosidase | | କ No ଣସି କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇପାରିଲା ନାହିଁ (ND) |
| ଏଣ୍ଡୋଗ୍ଲାଇକୋସିଡେଜ୍ F1 | | ND |
| ଏଣ୍ଡୋଗ୍ଲାଇକୋସିଡେଜ୍ F2 | | ND |
| ଏଣ୍ଡୋଗ୍ଲାଇକୋସିଡେଜ୍ F3 | | ND |
| ଏଣ୍ଡୋଗ୍ଲାଇକୋସିଡେଜ୍ ଏଚ୍ | ND |
| ପ୍ରୋଟେଜ୍ | | ND |
ଗୁଣଧର୍ମ
| EC ସଂଖ୍ୟା | 3.5.1.52(ମାଇକ୍ରୋ ଅର୍ଗାନଜମରୁ ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ) |
| ମଲିକୁଲାର ଓଜନ | | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| ଇସୋଲେକ୍ଟ୍ରିକ୍ ପଏଣ୍ଟ | | 8. 14 |
| ସର୍ବୋତ୍କୃଷ୍ଟ pH | 7.0-8.0 |
| ସର୍ବୋଚ୍ଚ ତାପମାତ୍ରା | | 65 ° C |
| ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା | | GlcNAc ଏବଂ asparagine ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ମଧ୍ୟରେ ଗ୍ଲାଇକୋସିଡିକ୍ ବନ୍ଧଗୁଡିକ ସଫା କରିବା ଚିତ୍ର 1 | |
| ଚିହ୍ନଟ ସାଇଟଗୁଡିକ | N1-fucose ଚିତ୍ର 2 ଧାରଣ ନକଲେ N- ସଂଯୁକ୍ତ ଗ୍ଲାଇକାନ୍ | |
| ସକ୍ରିୟକାରୀ | DTT |
| ପ୍ରତିବନ୍ଧକ | | SDS |
| ସଂରକ୍ଷଣ ତାପମାତ୍ରା | | -25 ~ -15 ℃ |
| ଉତ୍ତାପ ନିଷ୍କ୍ରିୟତା | | PNµase F ର 1µL ଧାରଣ କରିଥିବା ଏକ 20µL ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ମିଶ୍ରଣ 75 ° C ରେ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ନିଷ୍କ୍ରିୟ ହୋଇଯାଏ | |
ଚିତ୍ର 1 PNGase F ର ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା |
ଚିତ୍ର 2 PNGase F ର ସ୍ୱୀକୃତି ସିଟ୍ |
ଯେତେବେଳେ ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ GlcNAc ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶଗୁଡିକ α1-3 ଫ୍ୟୁକୋଜ୍ ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ, PNGase F ଗ୍ଲାଇକୋପ୍ରୋଟେନ୍ ରୁ N- ଲିଙ୍କ୍ ହୋଇଥିବା ଅଲିଗୋସାକାରାଇଡ୍ଗୁଡ଼ିକୁ ଖଣ୍ଡନ କରିପାରିବ ନାହିଁ |ଉଦ୍ଭିଦ ଏବଂ କିଛି କୀଟ ଗ୍ଲାଇକୋପ୍ରୋଟେନ୍ରେ ଏହି ପରିବର୍ତ୍ତନ ସାଧାରଣ ଅଟେ |
Cଉପାଦାନଗୁଡିକ
|
| ଉପାଦାନଗୁଡ଼ିକ | | ଏକାଗ୍ରତା | |
| 1 | PNGase F। | 50 µl |
| 2 | 10 × ଗ୍ଲାଇକୋପ୍ରୋଟେନ୍ ଡେନାଟରିଂ ବଫର୍ | | 1000 µl |
| 3 | 10 × ଗ୍ଲାଇକୋ ବଫର୍ 2 | | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | | 1000 µl |
ୟୁନିଟ୍ ସଂଜ୍ଞା
ଗୋଟିଏ ୟୁନିଟ୍ (U) କୁ 10 µL ର ମୋଟ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପରିମାଣରେ 1 ଘଣ୍ଟା ମଧ୍ୟରେ 10 µg ଡେନାଟେଟେଡ୍ RNase B ରୁ 95% କାର୍ବୋହାଇଡ୍ରେଟ୍ ଅପସାରଣ ପାଇଁ ଆବଶ୍ୟକ ଏନଜାଇମ୍ ପରିମାଣ ଭାବରେ ବ୍ୟାଖ୍ୟା କରାଯାଇଛି |
ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଅବସ୍ଥା |
1. ଡିଅନାଇଜଡ୍ ପାଣି ସହିତ 1-20 µg ଗ୍ଲାଇକୋପ୍ରୋଟେନ୍ ମିଶାନ୍ତୁ, 10 µl ସମୁଦାୟ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପରିମାଣ ତିଆରି କରିବାକୁ 1 µl 10 × ଗ୍ଲାଇକୋପ୍ରୋଟେନ୍ ଡେନାଟରିଂ ବଫର୍ ଏବଂ H2O (ଯଦି ଆବଶ୍ୟକ ହୁଏ) ମିଶାନ୍ତୁ |
2.10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 100 ° C ରେ ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ କରନ୍ତୁ, ଏହାକୁ ବରଫରେ ଥଣ୍ଡା କରନ୍ତୁ |
3.2 µl 10 × ଗ୍ଲାଇକୋ ବଫର୍ 2, 2 µl 10% NP-40 ମିଶାନ୍ତୁ ଏବଂ ମିଶ୍ରଣ କରନ୍ତୁ |
4.1-2 µl PNGase F ଏବଂ H ଯୋଗ କରନ୍ତୁ |2O (ଯଦି ଆବଶ୍ୟକ ହୁଏ) ଏକ 20 µl ସମୁଦାୟ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଭଲ୍ୟୁମ୍ ଏବଂ ମିଶ୍ରଣ କରିବାକୁ |
5.60 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 37 ° C ରେ ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା |
6.SDS-PAGE ବିଶ୍ଳେଷଣ କିମ୍ବା HPLC ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ |
