RTL ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜ୍ |
RTL ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜ୍ ହେଉଛି ଏକ RNA ଟେମ୍ପଲେଟ୍-ନିର୍ଭରଶୀଳ DNA ପଲିମେରେଜ୍ ଯାହା 3 '→ 5' ଏକ୍ସୋନ୍ୟୁକ୍ଲିଜ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପର ଅଭାବ ଏବଂ RNase H କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଅଛି |ଏହି ଏନଜାଇମ୍ DNA ର ଏକ ସଂପୃକ୍ତ ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡ୍ ସିନ୍ଥାଇଜ୍ କରିବା ପାଇଁ RNA କୁ ଏକ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଭାବରେ ବ୍ୟବହାର କରିପାରିବ, ଯାହା ପ୍ରଥମ-ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡ୍ ସିଡିଏନ୍ଏ ସିନ୍ଥେସିସ୍ ଉପରେ ପ୍ରୟୋଗ ହୋଇପାରିବ, ବିଶେଷତ RT RT-LAMP (ଲୁପ୍-ମଧ୍ୟସ୍ଥ ଆଇସୋଥର୍ମାଲ୍ ଆମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍) ପାଇଁ |RTL ରିଭର୍ସ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପେଟେଜ୍ 1.0 ସହିତ ତୁଳନା କଲେ ସମ୍ବେଦନଶୀଳତା ଯଥେଷ୍ଟ ଉନ୍ନତ ହୁଏ, ତାପଜ ସ୍ଥିରତା ଅଧିକ ଶକ୍ତିଶାଳୀ ହୁଏ ଏବଂ 65 ° C ରେ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଅଧିକ ସ୍ଥିର ହୋଇଥାଏ |ଲିଓଫିଲାଇଜଡ୍ ପ୍ରସ୍ତୁତି, ଲାଇଫିଲାଇଜଡ୍ RT-LAMP ରେଜେଣ୍ଟ ଇତ୍ୟାଦି ପ୍ରସ୍ତୁତ କରିବା ପାଇଁ RTL ରିଭର୍ସ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜ୍ (ଗ୍ଲାଇସେରଲ୍ ମୁକ୍ତ) ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇପାରିବ |
ୟୁନିଟ୍ ସଂଜ୍ଞା
ଗୋଟିଏ ୟୁନିଟ୍ 1 nmol dTTP କୁ ଏସିଡ୍-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପଦାର୍ଥରେ 20 ମିନିଟରେ 50 ° C ରେ ପଲି (A) • ଅଲିଗୋ (dT) 25 ଟେମ୍ପଲେଟ୍-ପ୍ରାଇମର୍ ଭାବରେ ବ୍ୟବହାର କରେ |
ଉପାଦାନଗୁଡ଼ିକ |
| ଉପାଦାନ | | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜ୍ (ଗ୍ଲାଇସେରଲ୍ ମୁକ୍ତ) (15U / μL) | 0.1 ମି.ଲି. | 1 ମି | 10 ମି |
| 10 × HC RTL ବଫର୍ | | 1.5 ମି.ଲି. | 4 × 1.5 ମି | 5 × 10 ମି |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 ମି.ଲି. | 2 × 1.5 ମି | 3 × 10 ମି |
ସଂରକ୍ଷଣ ଅବସ୍ଥା
0 ° C ତଳେ ପରିବହନ ଏବଂ -25 ° C ~ -15 ° C ରେ ଗଚ୍ଛିତ |
ଗୁଣବତ୍ତା ନିୟନ୍ତ୍ରଣ
- ଅବଶିଷ୍ଟ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପEndonuclease:50 μL ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ 1 μg λDNA ଏବଂ 15 ୟୁନିଟ୍ RTL2.0 37 ରେ 16 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଇନକ୍ୟୁବେଡ୍ ହୋଇଥିବା ଜେଲ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ ଦ୍ୱାରା ନକାରାତ୍ମକ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ସହିତ ସମାନ pattern ାଞ୍ଚା ଦେଖାଏ |
- ଅବଶିଷ୍ଟ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପExonuclease:50 μL ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ 1 μg ହିନ୍ଦ Ⅲ ହଜମ ହୋଇଥିବା λDNA ଏବଂ 15 ୟୁନିଟ୍ RTL2.0 16 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ 37 at ରେ ଇନକ୍ୟୁବେଡ୍ ହୋଇଥିବା ଜେଲ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ ଦ୍ୱାରା ନକାରାତ୍ମକ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ସହିତ ସମାନ pattern ାଞ୍ଚା ଦେଖାଏ |
- ଅବଶିଷ୍ଟ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପନିକେଜ୍ |:ଏକ 50 μL ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ 1 μg ସୁପରକୋଏଡ୍ pBR322 ଏବଂ 15 ୟୁନିଟ୍ RTL2.0 37 ଘଣ୍ଟା ମଧ୍ୟରେ 4 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଇନକ୍ୟୁବେଡ୍ ହୋଇଥିବା ଜେଲ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ ଦ୍ୱାରା ନକାରାତ୍ମକ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ସହିତ ସମାନ pattern ାଞ୍ଚା ଦେଖାଏ |
- ଅବଶିଷ୍ଟ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପRNase:10 μL ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ 0.48 μg MS2 RNA ଏବଂ 15 ୟୁନିଟ୍ RTL2.0 37 ଘଣ୍ଟା ମଧ୍ୟରେ 4 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଇନକ୍ୟୁବେଡ୍ ହୋଇଥିବା ଜେଲ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ ଦ୍ୱାରା ନକାରାତ୍ମକ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ସହିତ ସମାନ pattern ାଞ୍ଚା ଦେଖାଏ |
- E. coli gDNA:ସହିତ ମାପ କରାଯାଇଛି |E.coliନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ HCD ଚିହ୍ନଟ କିଟ୍ RT 15 ୟୁନିଟ୍ RTL2.0 1 ରୁ କମ୍ ଧାରଣ କରେ |E. coliଜିନୋମ |
ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ସେଟଅପ୍ |
cDNA ସିନ୍ଥେସିସ୍ ପ୍ରୋଟୋକଲ୍ |
| ଉପାଦାନଗୁଡ଼ିକ | | ଭଲ୍ୟୁମ୍ |
| ଟେମ୍ପଲେଟ୍ RNA a | ବ al କଳ୍ପିକ |
| ଅଲିଗୋ (dT) 18 ~ 25 (50uM) କିମ୍ବା ରାଣ୍ଡମ ପ୍ରାଇମର୍ ମିଶ୍ରଣ (60uM) | 2 μL |
| dNTP ମିଶ୍ରଣ (ପ୍ରତ୍ୟେକ 10mM) | 1 μL |
| RNase Inhibitor (40U / uL) | 0.5 μL |
| RTL ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜ୍ 2.0 (15U / uL) | 0.5 μL |
| 10 × HC RTL ବଫର୍ | | 2 μL |
| ନ୍ୟୁକ୍ଲିଜ୍ ମୁକ୍ତ ଜଳ | | 20 μL ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ |
ଟିପ୍ପଣୀ:
1) ମୋଟ RNA ର ପରାମର୍ଶିତ ଡୋଜ୍ ହେଉଛି 1ng ~ 1μg |
2) mRNA ର ପରାମର୍ଶିତ ଡୋଜ୍ 50ng ~ 100ng ଥିଲା |
ଥର୍ମୋ |-ସାଇକେଲ ଚଲାଇବା ଏକ ନିତ୍ୟକର୍ମ ପାଇଁ ସର୍ତ୍ତ | ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ：
| ତାପମାତ୍ରା (° C) | ସମୟ |
| 25 ° Ca | 5 ମିନିଟ୍ |
| 55 ° C | 10 ମିନିଟ୍b |
| 80 ° C | 10 ମିନିଟ୍ |
ଟିପ୍ପଣୀ:
1) ଯଦି ରାଣ୍ଡମ ପ୍ରାଇମର୍ ମିକ୍ସ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ, 25 ° C ରେ ଏକ ଇନକ୍ୟୁବେସନ ଷ୍ଟେପ୍ |
2) ଯଦି ଟାର୍ଗେଟ୍ ପ୍ରାଇମର୍ ମିଶ୍ରଣ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ, 10 ~ 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 55 ° C ରେ ଏକ ଇନକ୍ୟୁବେସନ ଷ୍ଟେପ୍ |
RT-LAMP ପ୍ରୋଟୋକଲ୍ |
| ଉପାଦାନଗୁଡ଼ିକ | | ଭଲ୍ୟୁମ୍ | ଅନ୍ତିମ ଏକାଗ୍ରତା | |
| ଟେମ୍ପଲେଟ୍ RNA | | ବ al କଳ୍ପିକ | ≥10 କପି |
| dNTP ମିଶ୍ରଣ (10mM) | 3.5 μL | 1.4 ମି |
| FIP / BIP ପ୍ରାଥମିକ (25 ×) | 1 μL | 1.6 μM |
| F3 / B3 ପ୍ରାଥମିକ (25 ×) | 1 μL | 0.2 μM |
| LoopF / LoopB Primers (25 ×) | 1 μL | 0.4 μM |
| RNase Inhibitor (40U / μL) | 0.5 μL | 20 U / ପ୍ରତିକ୍ରିୟା |
| RTL ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜ୍ 2.0 (15U / μL) | 0.5 μL | 7.5 U / ପ୍ରତିକ୍ରିୟା | |
| Bst V2 DNA ପଲିମେରେଜ୍ (8U / μL) | 1 μL | 8 U / ପ୍ରତିକ୍ରିୟା |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 μL | 6 ମିମି (ମୋଟ 8 ମି) |
| 10 × HC RTL ବଫର୍ (କିମ୍ବା 10 × HC Bst V2 ବଫର୍) | 2.5 μL | 1 × (2mM Mg2 +) |
| ନ୍ୟୁକ୍ଲିଜ୍ ମୁକ୍ତ ଜଳ | | 25 μL ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ | - |
ଟିପ୍ପଣୀ:
1) ଭର୍ଟେକ୍ସିଂ ଏବଂ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗ୍ ସଂଗ୍ରହ କରିବାକୁ ସଂକ୍ଷେପରେ ମିଶ୍ରଣ କରନ୍ତୁ |1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ 65 ° C ରେ କ୍ରମାଗତ ତାପମାତ୍ରା ଇନକ୍ୟୁବେସନ |
2) ଦୁଇଟି ବଫର୍ ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ଏବଂ ସମାନ ରଚନା ଅଛି |
ଟିପ୍ପଣୀ |
1. -20 ° C ରେ ଗଚ୍ଛିତ ହେଲେ ଏହି ଉତ୍ପାଦ ଏକ ଧଳା କଠିନ ଗଠନ କରିବ |ଏହାକୁ -20 ° C ରୁ ବାହାର କରି ପ୍ରାୟ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ବରଫରେ ରଖନ୍ତୁ |ତରଳିବା ପରେ ଏହାକୁ କମ୍ପନ ଏବଂ ମିଶ୍ରଣ ଦ୍ୱାରା ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇପାରିବ |
2. cDNA ଉତ୍ପାଦ -20 ° C କିମ୍ବା -80 ° C ରେ ଗଚ୍ଛିତ ହୋଇପାରେ କିମ୍ବା PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପାଇଁ ତୁରନ୍ତ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇପାରେ |
3. RNase ପ୍ରଦୂଷଣକୁ ରୋକିବା ପାଇଁ, ଦୟାକରି ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ କ୍ଷେତ୍ରକୁ ସଫା ରଖନ୍ତୁ ଏବଂ କାର୍ଯ୍ୟ ସମୟରେ ପରିଷ୍କାର ଗ୍ଲୋଭସ୍ ଏବଂ ମାସ୍କ ପିନ୍ଧନ୍ତୁ |
