ଭ୍ୟାକ୍ସିନିଆ ଭାଇରସ୍ କ୍ୟାପିଂ ଏନଜାଇମ୍ |

ଭ୍ୟାକ୍ସିନିଆ ଭାଇରସ୍ କ୍ୟାପିଂ ଏନଜାଇମ୍ ଏକ ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ ଇ କୋଲି ଷ୍ଟ୍ରେନ୍ ଦ୍ Va ାରା ଉତ୍ପନ୍ନ ହୋଇଛି ଯାହା ଭ୍ୟାକ୍ସିନିଆ କ୍ୟାପିଂ ଏନଜାଇମ୍ ପାଇଁ ଜିନ୍ ବହନ କରିଥାଏ |ଏହି ଏକକ ଏନଜାଇମ୍ ଦୁଇଟି ସବନିଟ୍ (D1 ଏବଂ D12) କୁ ନେଇ ଗଠିତ ଏବଂ ଏହାର ତିନୋଟି ଏନଜାଇମାଟିଭ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଅଛି (D1 ସବନିଟ୍ ଦ୍ R ାରା RNA ଟ୍ରାଇଫୋସଫାଟେଜ୍ ଏବଂ ଗୁଆନିଲଟ୍ରାନ୍ସଫ୍ରେଜ୍ ଏବଂ D12 ସବନିଟ୍ ଦ୍ gu ାରା ଗୁଆନାଇନ୍ ମିଥାଇଲଟ୍ରାନ୍ସଫ୍ରେଜ୍) |ଭ୍ୟାକ୍ସିନିଆ ଭାଇରସ୍ କ୍ୟାପିଂ ଏନଜାଇମ୍ କ୍ୟାପ୍ ଗଠନର କାଟାଲାଇଜ୍ ପାଇଁ ପ୍ରଭାବଶାଳୀ ଅଟେ, ଯାହାକି RNA ର 5 ′ ଶେଷରେ 7-ମିଥାଇଲଗୁଏନାଲେଟ୍ କ୍ୟାପ୍ ଗଠନ (m7Gppp, Cap 0) କୁ ସଂଲଗ୍ନ କରିପାରିବ |ଇଉକାରିଓଟ୍ସରେ mRNA ସ୍ଥିରତା, ପରିବହନ ଏବଂ ଅନୁବାଦରେ କ୍ୟାପ୍ ଗଠନ (କ୍ୟାପ୍ 0) ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଭୂମିକା ଗ୍ରହଣ କରିଥାଏ |ଏନଜାଇମାଟିକ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଦ୍ R ାରା RNA କ୍ୟାପ୍ କରିବା ହେଉଛି ଏକ ପ୍ରଭାବଶାଳୀ ଏବଂ ସରଳ ପଦ୍ଧତି ଯାହା ଭିଟ୍ରୋ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍, ଟ୍ରାନ୍ସଫେକ୍ସନ୍ ଏବଂ ମାଇକ୍ରୋ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ୍ ପାଇଁ RNA ର ସ୍ଥିରତା ଏବଂ ଅନୁବାଦକୁ ଯଥେଷ୍ଟ ଉନ୍ନତ କରିପାରିବ |

ଉପାଦାନଗୁଡ଼ିକ |

ଭ୍ୟାକ୍ସିନିଆ ଭାଇରସ୍ କ୍ୟାପିଂ ଏନଜାଇମ୍ (10 U / μL)

10 × କ୍ୟାପିଂ ବଫର୍ |

ସଂରକ୍ଷଣ ଅବସ୍ଥା

ଷ୍ଟୋରେଜ୍ ପାଇଁ -25 ～ - 15 repeated ବାରମ୍ବାର ଫ୍ରିଜ୍-ଥ୍ ଚକ୍ରରୁ ଦୂରେଇ ରୁହନ୍ତୁ）

ଷ୍ଟୋରେଜ୍ ବଫର୍ |

20 ମିଟର Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,

1mM DTT, 0. 1mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% glycerol |

ୟୁନିଟ୍ ସଂଜ୍ଞା

ଭ୍ୟାକ୍ସିନିଆ ଭାଇରସ୍ କ୍ୟାପିଙ୍ଗ୍ ଏନଜାଇମର ଏକ ୟୁନିଟ୍, 37 ° C ରେ 1 ଘଣ୍ଟା ମଧ୍ୟରେ 80pm ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପ୍ଟରେ 10pmol GTP କୁ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରିବା ପାଇଁ ଆବଶ୍ୟକ ଏନଜାଇମର ପରିମାଣ ଭାବରେ ବ୍ୟାଖ୍ୟା କରାଯାଇଛି |

ଗୁଣବତ୍ତା ନିୟନ୍ତ୍ରଣ

Exonuclease:10U ର ଭ୍ୟାକିନିଆ ଭାଇରସ୍ କ୍ୟାପିଙ୍ଗ୍ ଏନଜାଇମ୍ ସହିତ 1μg λ- ହିନ୍ଦ III ହଜମ କରୁଥିବା DNA 37 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ 16 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଅଗରୋଜ୍ ଜେଲ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ ଦ୍ determined ାରା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇ ନାହିଁ।

ଏଣ୍ଡୋନ୍ୟୁକ୍ଲିଜ୍:10U ର ଭ୍ୟାକ୍ସିନିଆ ଭାଇରସ୍ କ୍ୟାପିଙ୍ଗ୍ ଏନଜାଇମ୍ 1μg λDNA ସହିତ 37 at ରେ 16 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ କ ag ଣସି ଅବକ୍ଷୟ ହୁଏ ନାହିଁ ଯାହା ଆଗରୋଜ୍ ଜେଲ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ ଦ୍ determined ାରା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା |

ନିକେଜ୍:16U ପାଇଁ 1 μg pBR322 ସହିତ 10 Va ଭ୍ୟାକ୍ସିନିଆ ଜୀବାଣୁ କ୍ୟାପିଂ ଏନଜାଇମ୍ 16 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ କ deg ଣସି ଅବକ୍ଷୟ କରେ ନାହିଁ ଯେପରି ଅଗରୋଜ୍ ଜେଲ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ ଦ୍ determined ାରା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଏ |

RNase:37U ରେ 4 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ 1.6μg MS2 RNA ସହିତ 10U ଭ୍ୟାକ୍ସିନିଆ ଜୀବାଣୁ କ୍ୟାପିଂ ଏନଜାଇମ୍ କ ag ଣସି ଅବକ୍ଷୟ କରେ ନାହିଁ ଯେପରି ଆଗରୋଜ୍ ଜେଲ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ ଦ୍ determined ାରା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା।

1.coli DNA:10U ର ଭ୍ୟାକିନିଆ ଭାଇରସ୍ କ୍ୟାପିଙ୍ଗ୍ ଏନଜାଇମ୍, E. coli 16S rRNA ଲୋକସ୍ ପାଇଁ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପ୍ରାଇମର୍ ସହିତ TaqMan qPCR ବ୍ୟବହାର କରି ଇ କୋଲି ଜେନୋମିକ୍ DNA ର ଉପସ୍ଥିତି ପାଇଁ ସ୍କ୍ରିନ କରାଯାଏ |E. coli genomic DNA ପ୍ରଦୂଷଣ ହେଉଛି ≤1 E. coli genome |

2.ଜୀବାଣୁ ଏଣ୍ଡୋଟୋକ୍ସିନ୍: ଚାଇନିଜ୍ ଫାର୍ମାକୋପିୟା IV 2020 ସଂସ୍କରଣ ଅନୁଯାୟୀ LAL- ପରୀକ୍ଷା, ଜେଲ୍ ସୀମା ପରୀକ୍ଷା ପଦ୍ଧତି, ସାଧାରଣ ନିୟମ (1143) |ଜୀବାଣୁ ଏଣ୍ଡୋଟୋକ୍ସିନ ବିଷୟବସ୍ତୁ ≤10 EU / mg ହେବା ଉଚିତ୍ |

ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପ୍ରଣାଳୀ ଏବଂ ସର୍ତ୍ତ |

1. କ୍ୟାପିଂ ପ୍ରୋଟୋକଲ୍ (ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପରିମାଣ: 20 μL)

ଏହି ପଦ୍ଧତି 10μg RNA (≥100 nt) ର କ୍ୟାପିଂ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ ପ୍ରଯୁଜ୍ୟ ଏବଂ ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଚାହିଦା ଅନୁଯାୟୀ ଏହାକୁ ମାପ କରାଯାଇପାରିବ |

I) 10μg RNA ଏବଂ Nuclease-free H2O କୁ 1.5 ମିଲି ମାଇକ୍ରୋଫ୍ୟୁଜ୍ ଟ୍ୟୁବରେ 15.0 µL ର ଅନ୍ତିମ ପରିମାଣରେ ମିଶାନ୍ତୁ |* 10 aping କ୍ୟାପିଂ ବଫର୍: 0.5 ମି ଟ୍ରାଇସ୍- HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8.0)

2) 5 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 65 at ରେ ଗରମ କରନ୍ତୁ ଏବଂ ପରେ 5 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ବରଫ ସ୍ନାନ କରନ୍ତୁ |

3) ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ କ୍ରମରେ ନିମ୍ନଲିଖିତ ଉପାଦାନଗୁଡ଼ିକୁ ଯୋଡନ୍ତୁ |

* 10 × କ୍ୟାପିଂ ବଫର୍ ： 0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH8.0)

4) 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 37 ° C ରେ ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ କରନ୍ତୁ, RNA ବର୍ତ୍ତମାନ କ୍ୟାପ୍ ହୋଇ ଡାଉନ୍ଷ୍ଟ୍ରିମ୍ ପ୍ରୟୋଗଗୁଡ଼ିକ ପାଇଁ ପ୍ରସ୍ତୁତ |

2. 5 ′ ଟର୍ମିନାଲ୍ | ଲେବଲ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା (ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପରିମାଣ: 20 μL)

ଏହି ପ୍ରୋଟୋକଲ୍ 5´ ଟ୍ରାଇଫୋସଫେଟ୍ ଧାରଣ କରିଥିବା RNA କୁ ଲେବଲ୍ କରିବା ପାଇଁ ଡିଜାଇନ୍ କରାଯାଇଛି ଏବଂ ଚାହିଦା ଅନୁଯାୟୀ ଏହାକୁ ମାପ କରାଯାଇପାରିବ |ଲେବଲ୍ ଅନ୍ତର୍ଭୂକ୍ତିର ଦକ୍ଷତା RNA ର ମୋଲାର ଅନୁପାତ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରଭାବିତ ହେବ: GTP, ଏବଂ RNA ନମୁନାରେ GTP ବିଷୟବସ୍ତୁ |

1) 1.5 ମିଲି ମାଇକ୍ରୋଫ୍ୟୁଜ୍ ଟ୍ୟୁବରେ ଉପଯୁକ୍ତ ପରିମାଣର RNA ଏବଂ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଜ୍ ମୁକ୍ତ H2O କୁ 14.0 µL ର ଅନ୍ତିମ ପରିମାଣରେ ମିଶ୍ରଣ କରନ୍ତୁ |

2) 5 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 65 at ରେ ଗରମ କରନ୍ତୁ ଏବଂ ପରେ 5 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ବରଫ ସ୍ନାନ କରନ୍ତୁ |

3) ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ କ୍ରମରେ ନିମ୍ନଲିଖିତ ଉପାଦାନଗୁଡ଼ିକୁ ଯୋଡନ୍ତୁ |

** GTP MIX GTP ଏବଂ ଅଳ୍ପ ସଂଖ୍ୟକ ମାର୍କର୍ କୁ ବୁ .ାଏ |GTP ର ଏକାଗ୍ରତା ପାଇଁ, ଅନୁସରଣ କରନ୍ତୁ |ଟିପ୍ପଣୀ 3 କୁ

4) 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 37 ° C ରେ ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ କରନ୍ତୁ, RNA 5 ′ end ବର୍ତ୍ତମାନ ଲେବଲ୍ ହୋଇଛି ଏବଂ ଡାଉନ୍ଷ୍ଟ୍ରିମ୍ ପାଇଁ ପ୍ରସ୍ତୁତ |

ପ୍ରୟୋଗଗୁଡ଼ିକ

1. ଅନୁବାଦ ଅନୁଧ୍ୟାନ / ଭିଟ୍ରୋ ଅନୁବାଦ ପୂର୍ବରୁ mRNA କ୍ୟାପିଙ୍ଗ୍ |

2. mRNA ର 5´ ଶେଷକୁ ଲେବଲ୍ କରିବା |

ବ୍ୟବହାର ଉପରେ ଟିପ୍ପଣୀ |

1.ଭ୍ୟାକିନିଆ କ୍ୟାପିଂ ଏନଜାଇମ୍ ସହିତ ଇନକ୍ୟୁବେସନ ପୂର୍ବରୁ RNA ର ସମାଧାନ ଗରମ କରିବା, ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପ୍ଟର 5´end ରେ ଦ୍ secondary ିତୀୟ ଗଠନକୁ ଅପସାରଣ କରିଥାଏ |ଜଣାଶୁଣା ଉଚ୍ଚ ଗଠିତ 5´ends ସହିତ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପାଇଁ ସମୟ 60 ମିନିଟ୍ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ବିସ୍ତାର କରନ୍ତୁ |

2. କ୍ୟାପିଂ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ RNA ବ୍ୟବହାର ପୂର୍ବରୁ ଶୁଦ୍ଧ ହେବା ଉଚିତ ଏବଂ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଜ୍ ମୁକ୍ତ ପାଣିରେ ସ୍ଥଗିତ ରଖିବା |EDTA ଉପସ୍ଥିତ ରହିବା ଉଚିତ ନୁହେଁ ଏବଂ ସମାଧାନ ଲୁଣମୁକ୍ତ ହେବା ଉଚିତ |

3. 5´ ଶେଷକୁ ଲେବଲ୍ କରିବା ପାଇଁ, ସମୁଦାୟ GTP ଏକାଗ୍ରତା ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ mRNA ର ମୋଲାର ଏକାଗ୍ରତା ଠାରୁ 1-3 ଗୁଣ ହେବା ଉଚିତ |

4. ପ୍ରକୃତ ଅନୁଯାୟୀ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପ୍ରଣାଳୀର ଭଲ୍ୟୁମ୍ ମାପ କିମ୍ବା ତଳକୁ ମାପ କରାଯାଇପାରେ |