M-MLV ନିଓସ୍କ୍ରିପ୍ଟ ରିଭର୍ସ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜ୍ |
ନିଓସ୍କ୍ରିପ୍ଟ ରିଭର୍ସ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜ୍ ହେଉଛି ଏକ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜ୍ ଯାହା ଇ-କୋଲିରେ ମଲୋନି ମୁରିନ୍ ଲ୍ୟୁକେମିଆ ଜୀବାଣୁର M-MLV ଜିନ୍ ର ମ୍ୟୁଟେସନ୍ ସ୍କ୍ରିନିଂ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରାପ୍ତ |ଏନଜାଇମ୍ RNase H କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ଅପସାରଣ କରିଥାଏ, ଅଧିକ ତାପମାତ୍ରା ସହନଶୀଳତା ଏବଂ ଉଚ୍ଚ-ତାପମାତ୍ରା ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପାଇଁ ଉପଯୁକ୍ତ |ତେଣୁ, RNA ଉଚ୍ଚ ସ୍ତରୀୟ ସଂରଚନା ଏବଂ cDNA ସିନ୍ଥେସିସ୍ ଉପରେ ଅଣ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ କାରଣଗୁଡିକର ଅନୁକୂଳ ପ୍ରଭାବକୁ ଦୂର କରିବା ପାଇଁ ଏହା ସହାୟକ ହୋଇଥାଏ, ଏବଂ ଏହାର ଉଚ୍ଚ ସ୍ଥିରତା ଏବଂ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ସିନ୍ଥେସିସ୍ କ୍ଷମତା ଅଛି |ଏନଜାଇମର ଉଚ୍ଚ ସ୍ଥିରତା ଏବଂ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ସିନ୍ଥେସିସ୍ କ୍ଷମତା ଅଛି |
ଉପାଦାନଗୁଡ଼ିକ |
1.200 U / μL ନିଓସ୍କ୍ରିପ୍ଟ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜ୍ |
2.5 × ପ୍ରଥମ-ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡ୍ ବଫର୍ (ବ al କଳ୍ପିକ)
* 5 × ପ୍ରଥମ-ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡ୍ ବଫର୍ରେ dNTP ଧାରଣ କରେ ନାହିଁ, ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ସିଷ୍ଟମ୍ ପ୍ରସ୍ତୁତ କରିବାବେଳେ ଦୟାକରି dNTP ଯୋଗ କରନ୍ତୁ |
ସୁପାରିଶ କରାଯାଇଥିବା ଆବେଦନ |
1.ଗୋଟିଏ ସୋପାନ qRT-PCR |
2.RNA ଜୀବାଣୁ ଚିହ୍ନଟ |
ସଂରକ୍ଷଣ ଅବସ୍ଥା
ଦୀର୍ଘକାଳୀନ ସଂରକ୍ଷଣ ପାଇଁ -20 ° C, ବ୍ୟବହାର ପୂର୍ବରୁ ଭଲ ଭାବରେ ମିଶ୍ରିତ ହେବା ଉଚିତ, ବାରମ୍ବାର ଫ୍ରିଜ୍-ଥରୁ ଦୂରେଇ ରୁହନ୍ତୁ |
ୟୁନିଟ୍ ସଂଜ୍ଞା
ଗୋଟିଏ ୟୁନିଟ୍ ପଲି (A) • ଅଲିଗୋ (dT) ବ୍ୟବହାର କରି 37 ° C ରେ 10 ମିନିଟରେ 1 nmol dTTP ଅନ୍ତର୍ଭୂକ୍ତ କରେ |25ଟେମ୍ପଲେଟ୍ / ପ୍ରାଇମର୍ ଭାବରେ |
ଗୁଣବତ୍ତା ନିୟନ୍ତ୍ରଣ
1.SDS-PAGE ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେଟିକ୍ ଶୁଦ୍ଧତା 98% ରୁ ଅଧିକ |
2.ବିସ୍ତାର ସମ୍ବେଦନଶୀଳତା, ବ୍ୟାଚ୍-ଟୁ-ବ୍ୟାଚ୍ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ, ସ୍ଥିରତା |
3.କ ex ଣସି ଏକ୍ସୋଜେନସ୍ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଜ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ନାହିଁ, କ ex ଣସି ଏକ୍ସୋଜେନସ୍ ଏଣ୍ଡୋନ୍ୟୁକ୍ଲିଜ୍ କିମ୍ବା ଏକ୍ସୋନ୍ୟୁକ୍ଲିଜ୍ ପ୍ରଦୂଷଣ ନାହିଁ |
ପ୍ରଥମ ଶୃଙ୍ଖଳା ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ସମାଧାନ ପାଇଁ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ସେଟଅପ୍ |
1.ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ମିଶ୍ରଣର ପ୍ରସ୍ତୁତି |
| ଉପାଦାନଗୁଡ଼ିକ | | ଭଲ୍ୟୁମ୍ |
| ଅଲିଗୋ (dT)12-18 ପ୍ରାଥମିକ କିମ୍ବା ରାଣ୍ଡମ୍ ପ୍ରାଇମର୍ |a କିମ୍ବା ଜିନ୍ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପ୍ରାଥମିକତା |b | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 ମିମି dNTP | | 1 μL |
| ଟେମ୍ପଲେଟ୍ RNA | | ମୋଟ RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| RNase ମୁକ୍ତ dH2O | 10 μL ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ |
ଟିପ୍ପଣୀ:a / b: ଦୟାକରି ଆପଣଙ୍କର ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଆବଶ୍ୟକତା ଅନୁଯାୟୀ ବିଭିନ୍ନ ପ୍ରକାରର ପ୍ରାଇମର୍ ଚୟନ କରନ୍ତୁ |
2.5 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 65 ° C ରେ ଗରମ କରନ୍ତୁ ଏବଂ 2 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ବରଫ ଉପରେ ଶୀଘ୍ର ଥଣ୍ଡା କରନ୍ତୁ |
3.ଉପରୋକ୍ତ ସିଷ୍ଟମରେ ନିମ୍ନଲିଖିତ ଉପାଦାନଗୁଡ଼ିକୁ ସମୁଦାୟ 20µL ପରିମାଣରେ ଯୋଡନ୍ତୁ ଏବଂ ଧୀରେ ଧୀରେ ମିଶ୍ରଣ କରନ୍ତୁ:
| ଉପାଦାନଗୁଡ଼ିକ | | ଭଲ୍ୟୁମ୍ (μL) |
| 5 × ପ୍ରଥମ-ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡ୍ ବଫର୍ | | 4 |
| ନିଓସ୍କ୍ରିପ୍ଟ ରିଭର୍ସ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜ୍ (200 U / μL) | 1 |
| RNase inhibitor (40 U / μL) | 1 |
| RNase ମୁକ୍ତ dH2O | 20 μL ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ |
4. ନିମ୍ନଲିଖିତ ସର୍ତ୍ତ ଅନୁଯାୟୀ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା କର:
(1) ଯଦି ରାଣ୍ଡମ ପ୍ରାଇମର୍ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ, ପ୍ରତିକ୍ରିୟା 25 ମିନିଟ୍ରେ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ, ଏବଂ ତା’ପରେ 50 at ରେ 30 ~ 60 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ କରାଯିବା ଉଚିତ୍;
(2) ଯଦି ଅଲିଗୋ dT କିମ୍ବା ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପ୍ରାଇମର୍ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଏ, ପ୍ରତିକ୍ରିୟା 50 at ରେ 30 ~ 60 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ କରାଯିବା ଉଚିତ |
5.ନିଓସ୍କ୍ରିପ୍ଟ ରିଭର୍ସ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟେଜକୁ ନିଷ୍କ୍ରିୟ କରିବା ଏବଂ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାକୁ ବନ୍ଦ କରିବା ପାଇଁ 5 ମିନିଟ ପାଇଁ 95 at ରେ ଗରମ କରନ୍ତୁ |
6.ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ଉତ୍ପାଦଗୁଡିକ ସିଧାସଳଖ PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ ଏବଂ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ପରିମାଣିକ PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇପାରେ, କିମ୍ବା ଦୀର୍ଘ ସମୟ ପାଇଁ -20 at ରେ ଗଚ୍ଛିତ ହୋଇପାରେ |
PCR Reaction ：
1.ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ମିଶ୍ରଣର ପ୍ରସ୍ତୁତି |
| ଉପାଦାନଗୁଡ଼ିକ | | ଏକାଗ୍ରତା | |
| 10 × PCR ବଫର୍ (dNTP ମୁକ୍ତ, Mg² + ମୁକ୍ତ) | 1 × |
| dNTPs (ପ୍ରତ୍ୟେକ dNTP 10mM) | 200 μM |
| 25 ମିମି MgCl |2 | 1-4 ମି |
| ଟ୍ୟାକ୍ ଡିଏନ୍ଏ ପଲିମେରେଜ୍ (5U / μL) | 2-2.5 U |
| ପ୍ରାଥମିକ 1 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| ପ୍ରାଥମିକ 2 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| ଟେମ୍ପଲେଟ୍ |a | ≤10% ପ୍ରଥମ ଶୃଙ୍ଖଳା ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ସମାଧାନ (2 μL) |
| ddH2O | 50 μL ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ |
ଟିପ୍ପଣୀ:ଉ: ଯଦି ଅତ୍ୟଧିକ ପ୍ରଥମ ଶୃଙ୍ଖଳା ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ସମାଧାନ ଯୋଗ କରାଯାଏ, PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପ୍ରତିବନ୍ଧିତ ହୋଇପାରେ |
2.PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପ୍ରଣାଳୀ |
| ପଦାଙ୍କ | ତାପମାତ୍ରା | ସମୟ | ଚକ୍ରଗୁଡିକ |
| ପୂର୍ବ-ବିଭାଜନ | | 95 ℃ | 2-5 ମିନିଟ୍ | | 1 |
| ଅବନତି | 95 ℃ | 10-20 ସେକେଣ୍ଡ୍ | 30-40 |
| ଆନ୍ନାଲିଙ୍ଗ୍ | | 50-60 ℃ | 10-30 ସେକେଣ୍ଡ୍ | |
| ସମ୍ପ୍ରସାରଣ | 72 ℃ | 10-60 ସେକେଣ୍ଡ୍ |
ଟିପ୍ପଣୀ |
1.42 ℃ ~ 55 range ପରିସର ମଧ୍ୟରେ ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ତାପମାତ୍ରା ଅପ୍ଟିମାଇଜେସନ୍ ପାଇଁ ଉପଯୁକ୍ତ |
2.ଏହାର ଉତ୍ତମ ସ୍ଥିରତା ଅଛି, ଉଚ୍ଚ ତାପମାତ୍ରା ଓଲଟା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ଆମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ ପାଇଁ ଉପଯୁକ୍ତ |ଏଥିସହ, RNA ର ଜଟିଳ ଗଠନମୂଳକ ଅଞ୍ଚଳ ଦେଇ ଦକ୍ଷତାର ସହିତ ଯିବା ପାଇଁ ଏହା ଅନୁକୂଳ ଅଟେ |ଆହୁରି ମଧ୍ୟ, ଏହା |ଗୋଟିଏ ସୋପାନ ମଲ୍ଟିପ୍ଲେକ୍ସ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ପରିମାଣିକ RT-PCR ଚିହ୍ନଟ ପାଇଁ ଉପଯୁକ୍ତ |
3.ବିଭିନ୍ନ PCR ବିସ୍ତାରଣ ଏନଜାଇମ୍ ସହିତ ଭଲ ସୁସଙ୍ଗତତା ଏବଂ ଉଚ୍ଚ ସମ୍ବେଦନଶୀଳତା RT-PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପାଇଁ ଉପଯୁକ୍ତ |
4.ଉଚ୍ଚ ସମ୍ବେଦନଶୀଳତା ପାଇଁ ଏକ-ଷ୍ଟେପ୍ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ପରିମାଣିକ RT-PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପାଇଁ ଉପଯୁକ୍ତ, ଟେମ୍ପଲେଟଗୁଡିକର ନିମ୍ନ ଏକାଗ୍ରତାର ଚିହ୍ନଟ ହାରକୁ ଫଳପ୍ରଦ ଭାବରେ ଉନ୍ନତ କରେ |
5.CDNA ଲାଇବ୍ରେରୀ ନିର୍ମାଣ ପାଇଁ ଉପଯୁକ୍ତ |
