Uracil DNA Glycosylase |
Uracil-DNA Glycosylase (UNG କିମ୍ବା UDG) ହେଉଛି ଇ.କୋଲିର ଏକ ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ କ୍ଲୋନ ଯାହାକି 25 kDa ର ଏକ ମଲିକୁଲାର ଓଜନ ସହିତ |ଏହା ୟୁରାସିଲ୍ ଧାରଣ କରିଥିବା ଏକକ-ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡେଡ୍ ଏବଂ ଡବଲ୍-ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡେଡ୍ ଡିଏନ୍ଏରୁ ମାଗଣା ୟୁରାସିଲ୍ ରିଲିଜ୍କୁ ଅନୁକରଣ କରିଥାଏ, ଏବଂ RNA ବିରୁଦ୍ଧରେ ନିଷ୍କ୍ରିୟ ଅଟେ, ଏବଂ PCR ବର୍ଦ୍ଧିତ ଉତ୍ପାଦଗୁଡିକର ପ୍ରଦୂଷଣକୁ ରୋକିବାରେ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇପାରେ |କାର୍ଯ୍ୟର ନୀତି ଏହା ଉପରେ ଆଧାରିତ ଯେ ଯଦି PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ dTTP ପାଇଁ dUTP କୁ ବଦଳାଯାଏ ଏବଂ dU ବେସ୍ ଧାରଣ କରିଥିବା PCR ଆମ୍ଲିଫିକେସନ୍ ଉତ୍ପାଦ ଗଠନ ହୁଏ, ତେବେ ଏନଜାଇମ୍ ସି-ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡେଡ୍ ଏବଂ ଡବଲ୍-ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡରେ U ବେସର ଗ୍ଲାଇକୋସିଡିକ୍ ବଣ୍ଡକୁ ଭାଙ୍ଗିପାରେ | PCR ଏବଂ PCR ବିସ୍ତାର ଉତ୍ପାଦକୁ ଡିଗ୍ରେଡ୍ କରନ୍ତୁ |
ସୁପାରିଶ କରାଯାଇଥିବା ଆବେଦନ |
ପ୍ରଦୂଷଣ ରୋକିବା ବୃଦ୍ଧି
ସଂରକ୍ଷଣ ଅବସ୍ଥା
ଦୀର୍ଘକାଳୀନ ସଂରକ୍ଷଣ ପାଇଁ -20 ° C, ବ୍ୟବହାର ପୂର୍ବରୁ ଭଲ ଭାବରେ ମିଶ୍ରିତ ହେବା ଉଚିତ, ବାରମ୍ବାର ଫ୍ରିଜ୍-ଥରୁ ଦୂରେଇ ରୁହନ୍ତୁ |
ଷ୍ଟୋରେଜ୍ ବଫର୍ |
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, Stabilizer, 50% Glycerol |
ୟୁନିଟ୍ ସଂଜ୍ଞା
37 ° C ରେ 1 ଘଣ୍ଟାରେ dU ବେସ୍ ଧାରଣ କରିଥିବା 1µg ଏକକ-ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡେଡ୍ ଡିଏନ୍ଏକୁ ଡିଗ୍ରେଡ୍ କରିବା ପାଇଁ ଆବଶ୍ୟକ ଏନଜାଇମର ପରିମାଣ ହେଉଛି 1 ୟୁନିଟ୍ |
ଗୁଣବତ୍ତା ନିୟନ୍ତ୍ରଣ
1.SDS-PAGE ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେଟିକ୍ ଶୁଦ୍ଧତା 98% ରୁ ଅଧିକ |
2.ବିସ୍ତାର ସମ୍ବେଦନଶୀଳତା, ବ୍ୟାଚ୍-ଟୁ-ବ୍ୟାଚ୍ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ, ସ୍ଥିରତା |
3.2 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ UNG ର 1U 50 treated ରେ ଚିକିତ୍ସା କରାଯିବା ପରେ, 103 କପି ତଳେ U ଧାରଣ କରିଥିବା ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ସଂପୂର୍ଣ୍ଣ ଭାବରେ ଖରାପ ହେବା ଉଚିତ ଏବଂ କ am ଣସି ବର୍ଦ୍ଧିତ ଉତ୍ପାଦ ଉତ୍ପାଦନ ହୋଇପାରିବ ନାହିଁ |
4.କ ex ଣସି ଏକ୍ସୋଜେନସ୍ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଜ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ନାହିଁ |
ନିର୍ଦ୍ଦେଶାବଳୀ
| ଉପାଦାନଗୁଡ଼ିକ | | ଭଲ୍ୟୁମ୍ (μL) | ଅନ୍ତିମ ଏକାଗ୍ରତା | |
| 10 × PCR ବଫର୍ (dNTP ମୁକ୍ତ, Mg² |+ମାଗଣା) | 5 | 1 × |
| dUTPs (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (dTTP କୁ ବଦଳାନ୍ତୁ) | - | 200-600 μM |
| 25 ମିମି MgCl |2 | 2-8 μL | 1-4 ମି |
| 5 U / μL Taq | | 0.25 | 1.25 U। |
| 5 U / μL UNG | | 0.25 (0.1-0.5) | 0.25 U (0.1-0.5) |
| 25 × ପ୍ରାଥମିକ ମିଶ୍ରଣ |a | 2 | 1 × |
| ଟେମ୍ପଲେଟ୍ | | - | Μ 1μg / ପ୍ରତିକ୍ରିୟା |
| ddH₂O | 50 ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ | - |
ଧ୍ୟାନ ଦିଅନ୍ତୁ: a: ଯଦି qPCR / qRT-PCR ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ, ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ପ୍ରୋବକୁ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ସିଷ୍ଟମରେ ଯୋଡାଯିବା ଉଚିତ |ସାଧାରଣତ ,, 0.2.μ μM ର ଏକ ଅନ୍ତିମ ପ୍ରାଥମିକ ଏକାଗ୍ରତା ଭଲ ଫଳାଫଳ ଦେଇପାରେ |ଯେତେବେଳେ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା କାର୍ଯ୍ୟଦକ୍ଷତା ଖରାପ ହୁଏ, ପ୍ରାଥମିକ ଏକାଗ୍ରତା 0.2-1 μM ପରିସର ମଧ୍ୟରେ ସଜାଡି ହୋଇପାରେ |ସାଧାରଣତ ,, ଅନୁସନ୍ଧାନର ଏକାଗ୍ରତା 0.1-0.3 μM ପରିସର ମଧ୍ୟରେ ଅପ୍ଟିମାଇଜ୍ ହୁଏ |ପ୍ରାଥମିକ ଏବଂ ଅନୁସନ୍ଧାନର ସର୍ବୋତ୍ତମ ମିଶ୍ରଣ ଖୋଜିବା ପାଇଁ ଏକାଗ୍ରତା ଗ୍ରେଡିଏଣ୍ଟ୍ ପରୀକ୍ଷଣଗୁଡିକ କରାଯାଇପାରିବ |
ଟିପ୍ପଣୀ |
1.UNG ଏନଜାଇମକୁ PCR ଆମ୍ଲିଫିକେସନ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପୂର୍ବରୁ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପ୍ରଣାଳୀରୁ ଦୂଷିତ DUTP ଆମ୍ପ୍ଲାଇଫେସନ୍ ଉତ୍ପାଦକୁ ଅପସାରଣ କରିବାକୁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇପାରିବ, ତାପରେ ଉତ୍ପାଦ ପ୍ରଦୂଷଣ ହେତୁ ମିଥ୍ୟା-ସକରାତ୍ମକ ଫଳାଫଳକୁ ଏଡାଇବା ପାଇଁ |
2.ଆଣ୍ଟି-ପ୍ରଦୂଷଣ PCR ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ ବ୍ୟବହୃତ ହେବାକୁ ଥିବା UNG ଏନଜାଇମ୍ ପାଇଁ ସର୍ବୋଚ୍ଚ ତାପମାତ୍ରା ସାଧାରଣତ 2 2 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 50; ଅଟେ;ନିଷ୍କ୍ରିୟ ଅବସ୍ଥା 5 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 95 is ଅଟେ |
3.ବାରମ୍ବାର ଫ୍ରିଜ୍-ଥରୁ ଦୂରେଇ ରୁହନ୍ତୁ, ଏବଂ ବଡ଼ ତାପମାତ୍ରାର ପରିବର୍ତ୍ତନକୁ ପ୍ରକାଶ କରନ୍ତୁ ନାହିଁ |
4.ବର୍ଦ୍ଧିତ ହେବାକୁ ଥିବା ବିଭିନ୍ନ ଜିନ୍ ଗୁଡିକରେ DUTP ର ବିଭିନ୍ନ ବ୍ୟବହାର ଦକ୍ଷତା ଏବଂ UNG ଏନଜାଇମ୍ ପ୍ରତି ସମ୍ବେଦନଶୀଳତା ଅଛି, ତେଣୁ, ଯଦି UNG ସିଷ୍ଟମର ବ୍ୟବହାର ଚିହ୍ନଟ ସମ୍ବେଦନଶୀଳତା ହ୍ରାସ କରେ, ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପ୍ରଣାଳୀକୁ ସଜାଡିବା ଏବଂ ଅପ୍ଟିମାଇଜ୍ କରାଯିବା ଉଚିତ, ଯଦି ଆପଣ ବ technical ଷୟିକ ସହାୟତା ଆବଶ୍ୟକ କରନ୍ତି, ଦୟାକରି ଯୋଗାଯୋଗ କରନ୍ତୁ | ଆମର କମ୍ପାନୀ
